类器官培养应用于定量生物学和药理学研究解析
研究背景：
临床前细胞培养和动物模型无法预测药物在人体内的安全性和功效，每年耗资数十亿美元，但无法有效解决对有需求患者的治疗发展。这些因素推动了在体外模拟复杂人类生理学的方法的爆发式增长，其中融合了多条平行的科学和技术线，包括多能干细胞(PSC)和类器官生物学;3D组织和器官培养的设计原理和工具;微流控和中流控的灌注流控制方法;以及定量系统药理模型。这些技术推动了被称为“微生理系统”(MPS)或“器官芯片”(OOC)的发展，其中包括(i)灌注流以改善生理学条件或工作流程，即使对于单层培养的单一细胞类型，以及(ii)包含多种不同细胞类型的3D培养物，可代表器官或组织功能。
药物代谢和安全药理学是临床前药理学和毒理学应用的重点。对于这些应用，单个MPS和相互连接的多MPS平台的设计主要侧重于模拟一种或两种细胞类型代表的突出的生理功能，如吸收、代谢或屏障功能。但是，一方面，越来越多的研究发现，临床前药理学和毒理学中的主要生物学现象通常在单个MPS中涉及多种细胞类型与复杂的机械性。另一方面，药物失败主要是由于缺乏功效而不是药物毒性所致。例如糖尿病、阿尔茨海默氏病和关节炎，这些疾病可能涉及多个器官和组织。因此，以评估靶标和疗效为目标的疾病建模正在成为研究前沿领域，推动具有可灌注微血管网络和其他高级组织功能的复杂MPSs的发展。
同时，多MPS平台也不断发展以支持更复杂的MPS配置，用于分析多模式器官-器官相互作用。这些平台带来了一系列的概念和技术挑战。从概念上讲，第一个挑战是恰当地模拟生理问题–例如，确定小分子药物清除率所需的MPS组成(很少与生物疗法相同)，并且功效评估都是唯一的。其次，在没有通用解决方案的情况下，缩放MPS(组织/组织和组织/培养基的比例)以获得足够的体外-体内转化(IVIVT)仍然是一个挑战。最常见的缩放方法是直接微型化和异速缩放。而技术挑战层面包括：(i)创建和维护在扩展的培养期内具有足够代表性和强大生理功能的MPS，通常需要大量资源的采购和原代细胞或多能干细胞(PSC)的制备，并在专门的微环境中达到功能成熟;(ii)设计和制造可容纳和维持相关MPS的平台硬件，包括需要不同成熟时间和复杂成熟介质的MPS从平台外转移到平台上，同时将它们连接在一起用于对包括药物命运或疾病现象在内的生物学现象进行定量分析;(iii)选择与平台上不同MPS兼容的介质组合;(iv)其他各种实际和转化方面，包括流量分配、流速、生理传感器、采样频率和样本量等。
本文中，作者描述了多MPS平台的开发和实施，如图1所示，在这些概念和技术挑战的背景下，支持4路、7路和10路MPS相互作用数周。研究者专注于MPS相互作用的药理测试，从而说明了定量系统药理学模型(QSP)在实验设计和解释与平台设计和操作相集成方面的应用。QSP最初被定义为转化医学中用于阐明药理学概念并将其应用于治疗学开发和使用的一种实验与计算相结合的方法，但目前已扩展到多MPS技术的开发。用于表征体内模型中药物动力学与生物学效应关系的经验药代动力学和药效学(PKPD)模型不能直接用于多MPS平台;相反，MPS设计的多样性要求使用PKPD模型，该模型包括更多的机械细节以模拟相关的物理动力学(如MPS中的流速)和生物学动力学(如药物代谢和转运、细胞因子/生长因子/激素的产生和释放)，以选择合适的实验条件、分析结果并预测人体表达。QSP实验设计考虑了每个MPS中的细胞数量和类型，介质体积以及不同MPS配置之间的流动模式(流通或闭合)，并涉及药物暴露与MPS反应之间关系的表征。MPS和总系统流速之间的流量分配以及MPS配置(即，每个MPS中的扩散或其他分子运输障碍)是每个MPS中药物暴露的操作驱动因素。
在这项工作中开发和表征的平台(图1)源自Liverchip®技术使用的开放系统和多孔板格式，现已开发该平台用于3D肝细胞微生理系统的长期灌注培养，并且扩展到了双通道(肠-肝)MPS药代动力学和炎症相互作用。这些新平台结合了高自由度(DOF)的泵送系统，具有宽范围的流速和低药物结合力，可精确控制MPS内部和MPS间介质的混合和分配。这项技术可以同时调节循环回路中不同MPS之间和MPS内部的流速，这也是大多数流体控制系统所缺少的功能。
图1.芯片生理系统方法概述。芯片上生理组包括生物工程设备，可培养许多相互关连的3D MPS，这些3D MPS表示每个目标器官的特定功能行为，旨在针对个性化应用(如药物命运或疾病建模)。通过互连MPS，动态多器官信号传导可以通过细胞因子和激素循环，细胞损伤和代谢副产物自然重建。
该多MPS平台结构采用对亲脂性药物和激素耐吸附的材料，并且具有足够的泵送能力支持疾病建模，如癌症转移，在每个MPS中需要相对较大的(100多万个细胞)组织质量。平台容纳一个用于全身循环的混合室，一个循环流经支架(具有3D原代人肝细胞培养物)的肝脏模块，以及多达9个在底室中进行再循环的Transwell®格式的MPS模块。Transwell®MPS格式对肠、肺等屏障上皮组织具有吸引力，已建立许多用于构建具有不同程度生理通透性和排泄的完整的上皮屏障的方案。此外，中枢神经系统(CNS)和其他组织和器官的模型也已建成适用于该平台的Transwell®格式。
本文作者证明了4-MPS(肝/免疫、肺、肠/免疫和子宫内膜)持续两周的功能维持。通过在4路平台上逐步提高流速，发现随着系统接近一个更快速的充分混合状态时，分泌蛋白的系统分布遵循可预测的模式。同时作者首次报道了的7-MPS的共培养。该系统除了前面提到的4个MPS，还包括另外3个MPS(大脑、心脏和胰腺)，并且能够在3周的相互作用中维持表型功能性培养。使用这种平台，以“口服”剂量给药于肠道屏障上皮的顶侧，作者对双氯芬酸(一种非甾体类抗炎药)的体外药代动力学进行了定量。结果发现在该系统中，药物及其代谢产物的计算预测和测量浓度之间存在很强的一致性。另外，作者还配置了包括肾脏、皮肤和骨骼肌MPS在内的10-MPS平台。该10路平台在连续交互模式下成功运行，并能维持MPS表型功能4周时间。
这些数据，证明了作者使用集成泵硬件和QSP进行多MPS实验方法的有效性，从而能够为临床前药物研发以及临床转化应用进行高质量的生物学研究。以可重建的方式(通过4路、7路和10路设计的迭代开发)对多个相互作用的MPSs进行长期共培养和分析的方法的优势，对涉及复杂生物反应的非商业应用也很有吸引力。但即便使用10个MPS，该平台也无法复制人类完整情况，并且需要QSP建模来概念化相关的生理学并解释实验结果。
研究思路和结果：
多MPS平台的设计和制造
结合多MPS平台的特点，作者完善了系统的硬件设计。此处描述的多MPS平台的预期应用是通过细胞因子、生长因子和其他分子通讯模式检测多MPS之间的分子相互作用。这种设想推动了开放系统的硬件设计，允许在每个MPS隔室内对系统介质进行手动采样。开放式系统还促进了每个MPS的内部循环回路，以确保内部再循环速率比不同MPS之间的流速大10-100倍的情况下充分混合(图2)。对于上皮屏障组织(例如肠、子宫内膜和肺)，需要有顶端和基底隔室，以及完整的上皮屏障可以定期通过跨上皮电阻(TEER)来表征，因此选择现有的Transwell®型结构配置。对于肝脏，先前研究表明3D培养物对功能维护的性能更好，通过对3D组织的循环微灌流来增强局部氧、营养素和药物的交换，且与全身循环速率无关。因此，这里采用了以前开发的Liverchip®设计。
与上皮屏障组织不同，非屏障MPS(大脑、胰腺、心脏和肌肉)没有标准化的格式。每个MPS使用单独的大容量再循环泵，可以在制造时指定流通方式或Transwell®规格。对于7路平台，采用了已发布的Transwell®格式的大脑模块，并且10路平台上的心脏和所有其他模块也采用了同样的Transwell®模块。在7路平台上，胰腺MPS采用与肝脏MPS相同的流通模块。虽然这些设计考虑因素形成体积和组织比率不同于其它情况，但此处采用的QSP建模方法以机械方式结合了每个MPS的操作特征，来设计交互实验和数据解释。
用于N向相互作用的多MPS平台是一种形状因子类似于微量滴定板的微机械加工的生物反应器装置，由3层组成：顶(流体)板，柔性膜层和底(气动)板。4-MPS、7-MPS和10-MPS平台的展开效果图如图2所示。顶板由一块整体的聚砜(PSF)塑料制成，包括可容纳每个MPS的隔室和一个额外的腔室来集成和混合回流(混合器)，代表系统循环。微流体通道和泵被加工到顶板的下侧，将流体从混合室输送到每个MPS。可单独访问的微型泵根据流体通道制造，并基于先前描述的3腔正排量设计。每个MPS隔室下方的额外泵提供再循环流，以混合MPS中的介质，增强营养物质和氧气的输送，并允许独立于整体系统再循环(混合)速率来控制MPS内部混合。
MPS板的流体回流和自我调平是通过板顶表面上的溢流通道系统实现的，该系统将介质输送回混合器。溢流通道消除了对回流泵和液位传感器的需求，实现流入量和流出量之间的平衡。透明的丙烯酸底板用作气动歧管，以向每个泵局部输送加压的空气和真空，并用螺钉和弹簧垫圈固定在顶板上，以均匀地分配负载。一块聚氨酯薄膜夹在两块板之间，形成致动层并密封泵和通道。
多MPS平台可通过多条气动管线运行，每条气动管线均可独立设置为压力或真空状态(通常为+/-40kPa)，因此代表了一个用于流体控制的自由度(DOF)。一个自由度可以用来驱动一个阀门，而三个自由度可以一起用来通过驱动两个阀门和一个中央泵室来产生一个容积泵。尽管每个可单独访问的泵都需要3DOF，但是通过共享气动歧管上的入口，可以使多个泵以相同的速率运行，从而允许多个泵由一个三联体的气动管线驱动。使用这种并联配置可减少控制器中所需的气动开关阀的数量，以及进入培养箱的气动管的数量。4-MPS平台有9个泵，具有6个可独立编程的流量(18DOF)，而7-MPS平台有17个泵，具有12个可独立编程的流量(36DOF)。10-MPS平台有26个泵，还具有12个可分别编程的流量(36DOF)。10-MPS平台具有更高的并行度，可以使用与7-MPS平台相同的控制器。
这些平台均支持两种MPS格式，即流通模块或标准Transwell®插件，并在所有MPS隔室的下游都包含一个中央混合模块。流通模块格式与之前所述的相似，其中机载气动微流泵用于通过支架来灌注培养基，该支架支撑着一系列单独的3D肝组织样聚集体，这样在整个组织中具有近乎生理性的氧张力下降。最后，在整个设计过程中，对操作和采样过程中的平台的人体工程学进行反复评估，以确保易用性并将污染风险降到最低。
平台流体性能
为了在平台上实现有效混合并在MPS之间实现可预测的分子生物分布，至关重要的是要确保目标流量与实际流量之间的均等性以及各个泵的高可靠性。硬件的初始表征包括使用毛细管工具直接测量泵速。每单位时间高度变化的测量给出流量。当目标流量为1µL/s(2Hz)时，在13个4-MPS平台(每平台n=9个泵)的平均流量为0.92±0.12µL/s。10个7-MPS平台的流量(每个平台n=17个泵)平均为1.12±0.10µL/s。这些偏差可能是由于泵腔深度的轻微加工差异引起的。作者同时发现，根据初始测量结果计算出的软件校准因子可以将泵速校正到目标流量的±5%之内(0.99±0.056µL/s)。在实践中，这种低误差范围允许可靠且确定性的操作，因此可以进行准确的数据解释。通过使所有泵以2Hz的频率连续运行约6周(720万次循环)，对平台进行了压力测试。最终流速检测在初始值的10%以内，并且在目测检查未发现膜损伤。同时发现组成10-MPS系统的平板的流速与4-MPS和7-MPS系统的流速相似。
互连MPS长期功能的维持
在评估对干预措施的反应之前，对MPS相互作用的功能行为进行了长达2周(4-MPS)、3周(7-MPS)和4周(10-MPS)的时间表征。4-MPS平台研究包括肝、肠、肺和子宫内膜MPS，而7-MPS实验增加了脑、心脏和胰腺MPS。10-MPS平台包括另外三个系统：皮肤、肾脏和骨骼肌MPS。除了肝脏MPS在交互实验开始前3天在平台上建立外，所有MPS均在平台外成熟并在第一天转移到平台上。各种MPS中使用的细胞均来自具有不同培养基需求的原代细胞(肝、肺、胰腺，皮肤、骨骼肌、肾脏、肠道和肝脏中的免疫细胞)、PSCs(心脏、大脑)和细胞系(子宫内膜、肠道)，因此没有共同的培养基。在交互实验开始时，每个MPS将在各自的维持培养基平台上建立。在大多数多MPS研究中，根据人体每种组织类型输出量的相对百分比，分别将培养基从混合器分配到每个MPS，对应于4-MPS、7-MPS和10-MPS，系统相互作用流量分别为(Qsys)为5mL/天、10mL/天或20mL/天(每天交换率分别为系统总体积的60%、80%和110%)(如图2所示)。每48小时进行一次完整的培养基更换(替换每种MPS的特定维持培养基)，在此期间取样以测量每种MPS分泌的生物标志物浓度以及TEER和搏动频率。4-MPS、7-MPS和10-MPS研究的连续功能指标分别在图3、4和5中显示。
在4-MPS相互作用研究中(持续2周)，白蛋白分泌在开始的几天出现短暂增加，随后逐渐恢复到初始水平(图3)。肠/免疫和肺MPSs的屏障完整性用TEER定量。肠道/免疫MPS的TEER值在相互作用研究的早期波动，随后稳定在150-250Ω·cm2的范围内。肺MPS TEER值最初几天也呈现类似的高TEER趋势，但最终稳定在600-800Ω·cm2范围内。通过分泌胰岛素样生长因子结合蛋白1(IGFBP-1)来评估子宫内膜MPS功能，在整个研究期间，其功能维持在约20-30pg/天。除了IGFBP-1分泌率(4-12pg/天)低于相互作用研究(20-30pg/天)外，分离的子宫内膜MPS研究中各表型指标的变化趋势相似。
图3. 4-MPS平台中的MPS功能评估
对7-MPS(肠/免疫、肝/免疫、肺、子宫内膜、心脏、脑和胰腺)的生物相容性进行了3周的交互作用评估(图4)。与4-MPS结果相似，我们观察到白蛋白分泌动力学的瞬时变化(在本例中是一周后稳定)、持续的肠和肺TEER值以及IGFBP-1分泌。与心肌细胞相关的搏动频率被用作心脏MPS的功能指标。研究表明除第8天短暂增加至60-66次/分钟外，搏动频率稳定地保持在45-50次/分钟之间。分别以N-乙酰天门冬氨酸(NAA)和c肽释放曲线、神经元的代谢指标和胰岛β细胞的活性为指标，对培养3周的脑MPS和胰腺MPS功能进行研究。交互实验结果与分离实验结果的比较表明，交互作用对MPS功能没有负面影响。相反，作者观察到增强的NAA(脑)和c-肽(胰腺)的相互作用。
图4. 7-MPS平台中的MPS功能评估
最后，将10-MPS(肠/免疫、肝/免疫、肺、子宫内膜、心脏、脑、胰腺、肾脏、骨骼肌和皮肤)相互连接，并在4周内评估每个MPS的功能(图5)。与我们的4-MPS和7-MPS相互作用研究相似，白蛋白分泌动力学是瞬时的。在相互作用研究中，肠和肺MPS TEER检测值和趋势，子宫内膜MPS的IGFBP-1分泌以及心跳频率相当。在这项特殊的研究中，与7-MPS相互作用研究不同，大脑MPS包含iPSC衍生的神经元。与分离研究相比，NAA的分泌再次持续增强。本研究对胰腺MPS进行了的修饰，并对每个MPS以Transwell®形式添加了25个胰岛，观察到的c肽产生动力学与7-MPS平台结果相当。通过TEER监测的肾脏MPS屏障功能在整个实验过程中均得到保持，尽管来自相互作用研究的TEER值比来自分离研究的TEER值低3倍。肌肉MPS功能通过肌肉生长抑制素分泌(肌细胞释放的一种肌动蛋白)进行评估，结果显示直至第22天分泌都保持良好，之后在相互作用的后期阶段分泌减少。无论是相互作用还是分离研究，皮肤MPS的屏障功能都是暂时的，这表明其TEER的下降不是相互作用的结果。因此，在第14天用来自新供体的新皮肤MPS代替皮肤MPS。同样，树突状细胞数量的减少使研究者在第19天将这些细胞重新接种到肠道MPS中。
这些发现表明，对于需要长达四周培养的应用中，4-MPS，7-MPS和10-MPS平台保持了长期的MPS生存能力和功能。
图5. 10-MPS平台中的MPS功能评估
多MPS平台中的内源性和外源性分子分布
通过高自由度泵送方案实现对多MPS平台进行确定性操作，有助于进行体外数据解释以及将其转化为体内结果。在确定这些多MPS平台在机械上可靠并且可以支持多种MPS之间相互作用后，作者使用定量分子表征和QSP模型的集成方法研究了药物及其代谢产物的分子分布和定量测量。
在4-MPS平台中，在培养基更换过程中每隔48小时从每个隔室中收集样品，并使用PBPK计算模型分析结果来表征系统流速(Qsys)对内源性白蛋白分布动力学的影响。对混合室中测定的白蛋白浓度和PBPK模型中的数据进行比较，图6显示了实验第2天(Qsys=5ml/天，交换率为0.6系统总容量/天)、第4天(Qsys=15ml/天，1.9系统总容量/天)和第6天(Qsys=30ml/天，3.8系统总容量/天)各MPS室的情况。随着系统流量的增加，在4路平台上的MPS之间，白蛋白分布更加均匀。有趣的是，该流量递增实验还表明，将全身交换速率提高至每天约4倍总体积交换并未对肝功能产生明显不利影响，因为推测的白蛋白分泌率不会随全身介质交换速率的增加而改变。
图6. 4-MPS平台中系统流速的增加增强了MPS之间的分子交换，而MPS功能没有明显改变
作者以双氯芬酸(DCF)为例，研究了7-MPS平台的体外药代动力学，以验证该平台和QSP框架对药理学的适用性。首先，使用PBPK模型模拟MPS中DCF的分布，结合计划中的操作参数(MPS体积，流量)以及先前在隔离的MPS中测量的DCF清除率(肝脏)和渗透率(肠道)的值，来预测将60uM的DCF剂量应用于肠MPS基部(模拟口服)可在平台混合器中达到Cmax，与临床测量的相似(2-6µM)。给药后各MPS隔室(48小时)和混合室(24和48小时)中DCF及其代谢物4-OH-DCF的培养基浓度如图7所示，曲线显示了整个48小时的连续模型模拟。从平台上分布的大小和动态变化可以看出，每个隔室中测量浓度特征与PBPK模型的预测一致：肠道顶侧DCF的初始浓度为60µM，在15小时内基底腔室瞬时增加到约11µM，并且传播到肝脏的瞬时增加至约4µM，然后随着代谢物4-OH-DCF浓度的增加，在48小时内下降到2µM。同样，肝脏下游的混合器在24小时出现一个约2µM的峰值，与期望的Cmax一致，然后在接下来的24小时内，当DCF转化为4-OH-DCF时，缓慢下降。随后，下游MPS中的浓度升高，随着实验过程中培养基的混合更加充分，所有MPS培养基在48小时终点时浓度趋于相似。4-OH-DCF代谢产物由主要存在于肝脏MPS中的细胞色素酶p450产生，在整个7-MPS平台中循环，并在所有其他MPS隔室中检测到。
图7. 7-MPS平台中双氯芬酸药代动力学的定量分析
文章总结：
各种不同的多MPS平台技术正在涌现，以满足日益增长的对复杂人类生理反应的分析的需要，其应用范围从疾病建模到测试治疗干预的有效性和安全性。本文介绍的是一种全新的最多可支持10个复杂交互MPSs，并演示了QSP计算方法如何与平台技术结合来模拟内源性产生的分子和体外药物动力学的分布。这些结果为将该平台应用于疾病建模的各个方面奠定了基础。
该平台以新颖的方式进行了多性能结合，包括：开放系统架构;机载、可编程和可重新配置的泵，结合了高流量(0.05-300 uL/min)、高DOF和运行数周的可靠性;相对惰性的材料;现成的标准MPS结构以及定制设计;可用于培养箱的标准多孔板。本文中的平台都是开放系统格式，各种MPS都高度模块化，可以在操作过程中轻松更改，从而允许将单个MPS的替换作为实验方案的一部分。此功能已在7-MPS平台实验中得到了证实。此外，开放系统格式还允许在操作过程中访问所有MPS隔室(例如顶部和底部肠道腔室)，以进行手动采样和测量(如TEER，搏动频率)。另外，MPS之间的连接不必是线性或圆形的，这打破了许多封闭系统的固有限制。本文的平台设计在操作和处理过程中保持无菌性方面功能也较强，可以连续操作4周以上，并且MPS之间的培养基不断地系统循环。
本工作还证明了QSP模型如何应用于多MPS平台中的药理学实验的预测和解释，而随着MPS数量的增加，这一方法变得越来越具有挑战性。使用作者平台的PBPK模型的QSP方法对于确定实验操作策略(药物剂量、采样时间点、MPS内和MPS间培养基流速等)以获取有益的结果至关重要。通过将作者的实验结果与从PBPK模型计算出的4-MPS平台中的内源白蛋白分布和7-MPS平台中的外源性口服药物分布的研究中得出的理论分布值进行比较，作者证明了该多MPS平台可确定性地运行。这种可预测和可计算的平台操作使得将来能够研究此类平台上的PK/PD关系。此外，拥有可模拟整个平台上分子分布动力学的模型意味着我们可以通过仅从混合器中收集样品来简化实验操作，并预测其他隔室中的药物浓度。
本文实验本质上是原理验证，旨在证明平台技术和QSP模型的功能。尽管该技术在多达10-MPS交互方式下具有强大的功能，但需要大量的资源佐证(实验设计、MPS制备、样品分析等)，因此该技术被广泛用于高阶互作作用的概率极小。但是，作者预期该平台技术非常适合阐明涉及低阶(2-4MPS)相互作用的特定生物学或药理学问题。可为在各种慢性疾病(如帕金森氏病)中肠道、胰腺、肝脏和大脑之间的四向相互作用研究提供基础，QSP模型有助于平台配置的概念化和MPSs的缩放。单一和多种MPS格式中的一个悬而未决的问题是如何替换任何给定生理或疾病模型中缺失的MPSs(如内分泌等)的基本功能，目前正在出现解决这一需求的技术。
总而言之，作者展示了一种在流体平台内连接不同MPS的通用方法，可创建一种能够在先进药物发现应用中生成复杂分子分布特征的单芯片物理组学方法。这种适应性强、可重复使用的系统相对于现有的基于微流体和PDMS的方法具有独特和互补的优势，特别是对于涉及高logD物质(药物和激素)、需要精确和灵活控制MPS间流动分配和药物分配、以及需要长期(数周)可靠的流控和采样操作的应用。作者预计该平台可以应用于疾病建模和临床前药物开发中的各种问题，尤其是对于可操作的低阶(2-4MPS)相互作用。
文章来源:百思德生物
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