DNA甲基化检测的方法
目前就甲基化检测而言，方法众多，大体可以分为两类：甲基化分型检测和甲基化图谱分析(methylation profiling，也称甲基化组学)。
甲基化是指从活性甲基化合物上通过酶将甲基催化转移到其他化合物的过程。这种甲基化涉及重金属修饰、基因表达的调控、蛋白质功能的调节以及核糖核酸(RNA)的加工 。
甲基化包括DNA甲基化和蛋白质甲基化。DNA甲基化是重要的表观遗传学热点研究内容之一，调节基因的表达和关闭，与癌症、衰老、老年痴呆等许多疾病密切相关。DNA的甲基化一般发生在CpG位点，基因启动子及其附近区域内CpG的甲基化是基因实现沉默和基因印记的重要途径。
下面，小编就重点为大家介绍甲基化的检测方法。
甲基化分型检测
大多数的DNA甲基化分型基于PCR方法，模板为使用亚硫酸氢钠处理过的DNA，实验可使用两种类型的引物：甲基化非依赖性PCR引物(MIP)或甲基化特异性PCR引物(MSP)。
亚硫酸氢钠处理：1992年Frommer等首次报道了基于亚硫酸氢钠处理DNA的方法，后并被广泛使用，该法可有效保留DNA的甲基化信息，避免普通PCR过程中表观遗传学信息的丢失。
(一)基于MIP引物的检测方法
01、直接测序法
这种方法一度被认为是DNA甲基化分析的金标准。
过程：经过亚硫酸氢盐处理后，用PCR扩增目的片段，并对PCR产物进行测序，将序列与未经处理的序列进行比较，判断CpG位点是否发生甲基化。
这种方法可靠，且精确度高，能明确目的片段中每一个CpG位点的甲基化状态，但需要大量的克隆测序，过程较为繁琐、昂贵。
02、焦磷酸测序
焦磷酸测序技术Pyrosequencing作为一种新的序列分析技术，能够快速地检测甲基化的频率，对样品中的甲基化位点进行定性及定量检测。在序列延伸过程中，根据C和T的掺入量来定量确定单个位点的C-T比例，进而准确检测不同位点的甲基化变异。
过程：通过DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶、双磷酸酶及反应底物5 7磷酰硫酸、荧光素的酶级联反应，使得每一个dNTP的聚合酶与一次荧光信号的释放偶联，可极大提高检测的敏感性。
但焦磷酸测序的准确性受制于片段长度，CpG与前向引物3’端的距离也可影响检测结果的准确性。
03、结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法
Xiong and Peter报道了COBRA甲基化检测法，这种方法使用限制性酶消化PCR产物，区分甲基化和未甲基化的DNA。
过程：对标本DNA行重亚硫酸盐处理及PCR扩增，处理后原甲基化的胞嘧啶被保留，而非甲基化的胞嘧啶变为胸腺嘧啶。随后用限制性内切酶对转化后PCR产物切割的特性以识别原标本DNA的甲基化状况。
重亚硫酸盐处理DNA后行PCR扩增，用限制性内切酶(BstUI)识别转化后序列中的酶切位点，消化产物电泳分离，与完全非甲基化阴性对照组比较，得出序列中特异位点甲基化水平。
04、甲基化敏感性单核苷酸引物延伸
Gonzalgo and Jones 1997年提出了结合重亚硫酸盐处理和单核苷酸引物延伸(Kuppuswamy等1991年提出)的Ms-SnuPE方法，用于定量检测已知序列中特异位点的甲基化水平。
过程：应用MIP引物扩增所需检测序列，凝胶产物分离后退火加入内部引物。内部引物在DNA聚合酶的作用下聚合32P标记的dCTP或者drITllP延伸，产物可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。
缺点是：(1)实验步骤略复杂，若要检测多个位点时则需设计多个引物;(2)存在放射性污染及重亚硫酸盐处理不完全的问题。
05、甲基化敏感性解链曲线分析
Worm等2001年报道的MS-MCA是将DNA经重亚硫酸盐处理与Lightcycle联用检测DNA序列甲基化的方法。
使用荧光素标记双链DNA，由于甲基化DNA含有更多的GC，在Lightcycle过程中相对更难熔解，甲基化分析时可通过熔解温度及峰型的变化与标准曲线对比，区分完全甲基化、完全非甲基化或杂合甲基化。
缺点是：(1)它不能够精确检测甲基化的具体位点;(2)研究序列的长度不宜过长;(3)该法对低水平的DNA甲基化敏感性低。
06、甲基化敏感性高分辨率溶解曲线分析
HRM技术这是近几年国内外兴起的一项高新技术，基于此技术Tomasz K Wojdacz等开发了MS-HRM技术，基本原理同MS-MCA，针对甲基化区域附近设计引物，将修饰后的DNA做PCR，再进行低温到高温的溶解的过程，参照标准曲线，即可对样本做定性和定量的分析。
HRM方法可检测传统的MIP引物，也可以在MIP引物中引入少量的CpG位点来修正PCR偏倚并提高分析敏感性。MIP加入CpG位点的方法可将PCR偏倚推向甲基化一侧，并通过退火温度的控制可明显提升分析敏感性。
07、飞行质谱
美国Sequenom公司的MassARRAY® 平台可用于DNA甲基化分析。MassARRAY® EpiTYPER™ DNA 甲基化分析技术结合了碱基特异性酶切反应和 MALDI-TOF 检测原理，可实现多重CpG的分析检测。
待测DNA经过亚硫酸氢盐处理，未甲基化的胞嘧啶C转变为尿嘧啶U，由此在DNA模板中产生甲基化特异的序列变化。利用5'末端带有T7-启动子的引物进行PCR扩增，产物经SAP虾碱性磷酸酶处理后用于碱基特异性的酶切反应。酶切后DNA片段的大小和分子量取决于亚硫酸盐处理后的碱基变化，质谱测定每个片段的分子量，软件EpiTYPER则能自动报告每个相应片段的甲基化程度。此种方法无需任何荧光标记，每个反应覆盖长达500 bp的多个CpG位点，且灵敏度高，可检测低至5%的甲基化水平，适用于高通量的样本。
但由于其需要昂贵的设备，方法具有复杂性，限制了其临床应用。
08、重甲基法(HEAVYMETHYL)
此法为Cottrell等报道，在MIP引物基础上添加了寡核苷酸阻断剂区别甲基和未甲基化等位基因，阻断剂只识别未甲基化片段。
当存在甲基化位点，寡核苷酸探针无法结合，引物顺利结合并加以扩增，而非甲基化位点扩增则受到抑制。
重甲基法中阻断剂在每一个PCR循环均提供特异性识别，所以其假阳性率类似MSP方法，并具有高通量、闭管的特点。
那么，基于MSP引物的检测方法和甲基化图谱分析的方法都有哪些呢?
接下来，逐一为大家介绍。
(二)基于MSP引物的检测方法
1、甲基化特异性PCR (MS-PCR)
这种方法经济实惠，无需特殊仪器，目前应用最广。它将DNA先用重亚硫酸盐处理，这样未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶，而甲基化的不变，随后进行引物特异性的PCR。MS-PCR中需要设计2对引物，检测MSP扩增产物，根据处理后甲基化或非甲基化DNA链的引物能否扩增出片段判断被测位点是否存在甲基化 。
这种方法避免了使用限制性内切酶及其后续相关问题，敏感性高。但需要预先知道待测片段DNA的序列，同时引物设计非常重要，若待测DNA中5-甲基胞嘧啶分布极不均衡，则检测时较为复杂，可能出现假阳性。
2、荧光定量法(Methylight)
Methylight技术是2000年由Eads等报道，其原理是使用荧光水解探针，在MSP扩增同时检测荧光强度，使得定量检测甲基化成为可能。
首先用亚硫酸氢盐处理DNA片段，并设计一个能与待测位点互补的探针，随后开展实时定量PCR。
其优势在于高通量、高敏感性，且无需在PCR后电泳、杂交等操作，减少了污染和操作误差，可以做到多样本、多基因位点的快速分析。但费用较高，测定每个位点都要用两端标有荧光素的探针和一对引物，且受较多因素影响。
3、甲基化敏感性限制性内切酶PCR (MS-RE)/Southern法
此方法利用甲基化敏感性限制性内切酶对甲基化区的不切割的特性，将DNA消化为不同大小的片段后再进行分析。
常使用的甲基化敏感的限制性内切酶有HpaⅡ-MspⅠ(识别序列CCGG)和SmaⅠ-Xmal(CCCGGG)等。其中HpaⅡ和MspⅠ均能识别CCGG序列，当序列中的胞嘧啶发生甲基化时，HpaⅡ不切割，利用这种属性，进行Southern或PCR扩增分离产物，明确甲基化状态。
这种方法比较经典，成本较低，甲基化位点明确,结果容易判读，但是CG非该序列中的CG被忽略，Southern方法较复杂，需要样本的量大，不适用于混合样本，酶若不完全消化可能引起假阳性。
4、甲基化敏感性单链构象分析(MS-SSCA)
又称重亚硫酸盐甲基化PCR-SSCP(BiPS)，1999年由Maekawa等报道。由于DNA电泳时的移动性取决于其二级结构即DNA的空间构象，而后者又由DNA碱基的序列决定，因此，经处理后变性的单链DNA在电泳中移动速率不同，将停留在聚丙酰胺膜的不同位置上，从而判定待测片段中甲基化情况。
方法是先用重亚硫酸盐处理待测片段，针对非CG二核苷酸区设计引物进行PCR扩增，扩增产物变性后作非变性的聚丙酰胺凝胶电泳。
这种方法可应用于任何序列的甲基化状态分析，并能够对甲基化的等位基因进行半定量，但敏感性及准确性略低，检测片段不宜过长。
5、甲基化敏感性变性梯度凝胶电泳(MS-DGGE)
变性梯度凝胶电泳(DGGE)是一种能够将具有单碱基差别的DNA分离的方法。1999年Aggerholm等用重亚硫酸盐处理DNA使为甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶引起点突变，再结合使用DGGE，用于甲基化的检测。
原理：DNA片段在变性梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳时，凝胶中变性剂浓度自上而下呈梯度递增，当DNA片段到达与解链区域(长度大小不等)的T(解链温度)值相当的某一浓度位置时，DNA解链变为分枝状，移动减慢，停留在凝胶的的某一位置，则不同的DNA段就被分离。
此种方法不需预先知道CpG位点及样本序列，需要的样品量少，能较直观的显示出甲基化情况，但解链温度和DGGE的变性浓度梯度需要摸索，而且容易漏检。
6、甲基化敏感性斑点分析(MS-DBA)
2005年GClément等报道，能够定量或半定量分析样本中的甲基化水平。
这个方法的过程是：先用重亚硫酸盐处理待测DNA，随后以非CG区的引物行PCR扩增，将扩增产物变性后转移到尼龙膜上，用3'端DIG标记的含有2个CG(或TG)的双核苷酸探针与DNA杂交，随后用带有荧光标记的抗DIG抗体与之反应。与双CG的探针获得杂交的标本含有甲基化，而与TG探针杂交的标本未被甲基化。通过比较斑点上荧光的强度测定甲基化水平。
这种方法虽然快速、简便、易于掌握，也可一次检测多种样本，但检测序列不能过长，可能出现假阳性或假阴性结果。
7、甲基化特异性多连接依赖性探针扩(MS-MLPA)
MS-MLPA中，针对甲基化的和非甲基化的位点分别设计两个探针，每个探针包含两个寡核苷酸部分，其中短的部分由合成产生，长的部分来源于phageM13的衍生物，不同探针其长度不同，且探针要有甲基化敏感的限制性内切酶HhaⅠ(GCGC)或HpaⅡ(CCGG)的识别位点。探针的两个寡核苷酸杂交序列均与目标序列互补，其末端都连有相同的PCR引物。经探针和目标序列杂交后，降低反应体系温度，并向其中加入连接酶HhaⅠ，若原样本DNA中含有HhaⅠ识别的非甲基化的位点，则非甲基化探针的两个寡核苷酸部分不能连接，而甲基化的探针顺利连接不被切割，在随后的PCR反应中只有两个寡核苷酸部分连接后的探针才能被扩增。最后分析扩增片段，确定待研究位点的甲基化情况。
MS-MLPA需要样本量少，可以用于局部降解的DNA，也可用于分析大量混合样本，但探针连接位点受限制性内切酶位点识别的限制，且要考虑到所用酶的反应适宜温度。
甲基化图谱分析
1、液相色谱法
液相色谱法基础的甲基化图谱分析被认为是第一代甲基化谱的检测。其快速且定量，与质谱法相连可极大提高其检测敏感性，但只能检测总的甲基化水平，无法定位具体基因甲基化情况。
2、凝胶基础的甲基化图谱分析
代表为限制性酶切路标基因扫描(RLGS)技术。通过使用甲基化敏感的内切酶，优先对特定区域进行酶切(CpG岛)，并通过二维电泳的方式对产物进行分析，可显著提高对潜在位点的分析能力。可实现了对全基因范围的甲基化谱的分析，并可定位具体甲基化位点。
3、DNA微阵列法
2001年Yan等将以分子杂交为基础的微阵列技术应用于DNA甲基化检测中，这种方法是基于杂交的寡核苷酸微阵列，是一种在基因组中寻找新位点的方法。包括用于整个基因组范围内扫描的差异甲基化(DMH)杂交和用于检测某个位点的甲基化特异性微阵列MSO。
就甲基化图谱分析而言，目前流行的分析方法是芯片。很多公司都提供相关平台，如安捷伦的Human CpG Island Microarray Kit，Illumina的HumanMethylation27 DNA analysis BeadChip，Roche NimbleGen的Human DNA Meth 2.1M Deluxe Promoter Array和Affymetrix的seven-array GeneChip® Human Tiling 2.0R Array Set。
4、高通量测序
(1)Sanger测序
基础为MIP引物结合的sanger测序，通过亚硫酸处理模版，PCR扩增小片段，进行10至20个克隆，随后进行测序。关键在于ESME算法的应用，这一算法可将直接PCR产物测序结果计算甲基化值并调整亚硫酸处理导致的不完全转化因素，从而把测序结果组转化为长片段的甲基化测序结果。
Eckhardt等于2006年使用这一技术成功地对12种不同组织中的3条人类染色体进行了全甲基化谱的分析，产生了近200万个CpG甲基化信息，揭示了不同组织中表观遗传学的差异。
目前罗氏公司的GSFL—X测序仪，Illumina的1G基因测序仪及AppliedBiosystems的SOLID测序仪已能实现这一功能，新一代的平台通量更大、费用更低，然而由于测序片段更小需要更为复杂的计算机软件完成结果的综合及输出。
(2)二代测序
近两年，多个研究小组将传统的甲基化工具如DNA的亚硫酸氢盐转化与目标基因组捕获技术和高通量测序相结合，绘制出了多张甲基化图谱。
(3)三代测序
三代测序技术的出现让甲基化的直接测定成为可能。美国Pacific Biosciences公司利用独有的单分子实时SMRT测序技术，直接测定了DNA的甲基化，其成果发表在《Nature Methods》杂志上。
文章来源:北京康旭医学市场部
